Covid-19: Presença de inibidores de amplificação e RT-PCR falso-negativo

Desde a publicação, em 13 de janeiro do ano passado, pela Organização Mundial da Saúde (OMS), do primeiro protocolo de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) em tempo real, essa é a técnica molecular considerada de escolha (“padrão-ouro”) para o diagnóstico da infecção pelo SARS-CoV-2.

Apesar de ser uma metodologia com alta tecnologia embarcada e uma ótima sensibilidade e especificidade, assim como todo exame laboratorial, está sujeita a certos tipos de interferentes, inadequações e limitações próprias da técnica.

Algumas variáveis podem prejudicar seu desempenho analítico, dentre as quais podemos citar: o tipo de material biológico, a fase da doença em que o exame é feito, o procedimento de coleta, armazenamento, transporte, presença de inibidores de amplificação, manipulação da amostra, kit de extração e amplificação utilizado, etc.

Os inibidores de amplificação no RT-PCR

Algumas substâncias, representadas por um grupo amplo e heterogêneo, de matrizes orgânicas (ex.: sais biliares, etanol, hemoglobina, colágeno, IgG, proteinases) e inorgânicas (ex.: íons de cálcio), podem possuir efeitos inibitórios à PCR. Elas podem ser encontradas em diversos materiais biológicos (ex.: órgãos, sangue, fezes, líquidos biológicos), no meio ambiente (ex.: solo, ar, água) e até em alimentos (ex.: frutos do mar, carnes, frutas).

Essas substâncias, quanto presentes na amostra primária ou inseridas como contaminantes em alguma fase do processo, podem interferir na técnica de PCR, nas suas mais diversas etapas. Dessa forma, pode ocorrer uma perda da sensibilidade do teste, o que leva a um aumento de resultados falso-negativos.

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Tais resultados inadequados possuem um enorme impacto deletério em todo o processo de atendimento e manejo do quadro, gerando assim graves consequências ao paciente e à saúde pública de um modo geral.

Métodos para a remoção de inibidores

Vários mecanismos e procedimentos podem ser utilizados na tentativa de remover ou diminuir a ação desses inibidores. Agentes quelantes, métodos de precipitação e diálise, podem ser empregados para a neutralização de inibidores específicos.

O uso de colunas cromatográficas contendo, por exemplo, sílica, brometo de cetrimônio ou resinas de troca iônica, podem ser utilizadas na remoção de sais, polissacarídeos e pequenas proteínas em algumas matrizes.

Procedimentos de imunocaptura também são muito eficientes na captura de vírus e sua subsequente detecção por PCR, já que, por esse método, o patógeno pode ser separado da matriz e de seus inibidores da amostra, facilitando assim sua identificação pelo método molecular.

A maneira mais versátil e amplamente utilizada, consiste na diluição da amostra e/ou do ácido nucléico extraído. A grande desvantagem dessa técnica é que, ao se submeter o produto a uma diluição, ocorre uma redução significativa da sensibilidade, diminuindo a eficiência dos métodos moleculares, gerando assim mais resultados falso-negativos. O laboratório clínico deve se atentar em como se comportam as curvas de diluição da reação, evitando resultados imprecisos.

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Apesar de todos os esforços e procedimentos em se tentar remover os inibidores, algumas substâncias ainda podem se fazer presentes na amostra. Uma das maneiras de minimizar esse impacto é o uso de controles (competitivos e/ou não competitivos), que são analisados paralelamente às amostras, afim de auxiliar a exclusão resultados inconsistentes.

Mensagem final

A técnica molecular de RT-PCR é uma metodologia segura e eficaz para o diagnóstico de uma série de patologias, incluindo a Covid-19. Entretanto, a mesma possui algumas limitações, como é o caso da eventual presença de inibidores de amplificação na amostra, o que acarreta no aumento de resultados falso-negativos.

O uso de kits com propriedades intrínsecas que auxiliam na remoção desses inibidores, aliado às boas práticas laboratoriais, o uso de controles, bem como o conhecimento dos padrões das curvas de amostras diluídas, é de fundamental importância para a minimização de resultados inadequados.

Referências bibliográficas:

• Fruehwirth M, et al. Resultado falso negativo no diagnóstico molecular de SARS-CoV-2 em amostras com inibidores de amplificação. J. Bras. Patol. Med. Lab.2020;56(1):1-8. https://www.dx.doi.org/10.5935/1676-2444.20200060
• Schrader, C, et al. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol, 113: 1014-1026. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x