Método de Otimização dos Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos

Frente a necessidade de rapidez no diagnóstico de infecções bacterianas e na detecção da sensibilidade a antimicrobianos, têm-se desenvolvido métodos microbiológicos rápidos que permitam a obtenção de resultados precisos em períodos curtos de tempo. Tal urgência é justificada pela disseminação de bactérias multirresistentes em infecções diversas e pela necessidade da implementação da antibioticoterapia efetiva precoce em quadros clínicos graves como infecções de corrente sanguínea e choque séptico ². Os principais métodos utilizados com essa finalidade incluem os sistemas semi-automatizados de cultura e detecção etiológica, e a espectrometria de massa MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry) para agilizar os resultados laboratoriais ^3,6,7.

As tecnologias baseadas em cultura desenvolvidas, até então, para a detecção rápida do fenótipo de sensibilidade a antimicrobianos (rapid antimicrobial susceptibility testing, rAST) em laboratórios clínicos incluem ⁷:

 

Metodologia rAST7	Princípio7
Método de cultura em garrafa contendo antimicrobiano	Crescimento em meio líquido com avaliação visual da turbidez
Método colorimétrico utilizando indicador de pH	Crescimento bacteriano detectado pela alteração da coloração do meio de cultura contendo vermelho de fenol
Método colorimétrico utilizando indicador de oxi-redução	Crescimento bacteriano detectado pela alteração de coloração do meio de cultura contendo resazurina
Método de disco-difusão com incubação curta	Avaliação visual das zonas de inibição no antibiograma com disco-difusão após incubação curta
Sistema de canais de agarose microfluídicos com rastreio microscópio de crescimento de células	Bactérias são imobilizadas em matriz de agarose em canal microfluídicos, e o crescimento é monitorizado utilizando microscopia
Detecção luminosa do crescimento microbiano por escaneamento a laser	Detecção do crescimento visível em meio líquido por uso do laser
Microscopia digital em intervalos temporais	Crescimento visível por obtenção de imagens seriadas em meio líquido
Medida da massa celular microbiana	Medição da massa de alta resolução utilizando microcanais
Microcalorimetria isotérmica	Detecção do crescimento por medição da produção do calor
PCR em tempo real (PCR real-time)	Após a incubação em meio líquido, a PCR real-time é utilizada para a quantificação de cópias de DNA baseada nos genes RNA 16S ou rpoB
Bioluminescência-ATP	Ensaio de luciferina-luciferase com produção de luz na presença de ATP bacteriano
Fago reporter por luciferase	Infecção da bactéria com o fago e quantificação luminosa em caso de crescimento bacteriano
Análise da morfocinética celular	Imobilização das células bacterianas em superfície e registros digitais microscópicos subsequentes com inferência de valores para concentração mínima inibitória
Espectroscopia de mudança de fase intrínseca em arquiteturas de micropilares	Colonização bacteriana de estrutura tipo pilar e avaliação do crescimento por espectroscopia de mudança de fase por interferência reflectométrica em tempo real
Citometria de fluxo	Mensuração dos danos celulares microbianos induzidos por drogas
Espectrometria de massa MALDI-TOF direto em microgotas do crescimento em meio líquido	Incubação das suspensões bacterianas como microgotas diretamente nos alvos do MALDI, seguido por remoção da cultura e mensuração espectométrica

 

Os desafios da tecnologia rAST e sua otimização incluem inicialmente a necessidade de crescimento bacteriano e a expressão da resposta frente ao antimicrobiano. Adicionalmente, são necessários ajustes importantes quanto aos seguintes fatores: (i) infecção polimicrobiana; (ii) efeito do inóculo e aumento da biomassa inicial; (iii) expressão tardia da resistência; (iv) fase lag do crescimento. De forma a consistir em uma metodologia realmente promissora, requer facilidade técnica no manejo, acessibilidade universal, possibilidade de realização de testes simultâneos de múltiplos espécimes, e atraente custo-benefício ⁷.

 

Teste rápido de sensibilidade a antimicrobianos por disco-difusão (RAST)

Os obstáculos ainda persistem considerando os testes de sensibilidade a antimicrobianos devido à necessidade de cultura e identificação prévia do agente microbiano. No entanto, os laboratórios clínicos e instituições como o EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) têm aprimorado especialmente a metodologia denominada “Teste rápido de sensibilidade a antimicrobianos por disco-difusão” (rapid antimicrobial disk diffusion susceptibility testing ou RAST). A tecnologia é baseada em automação, diretamente a partir dos tubos de hemoculturas com crescimento positivo, com possibilidade de interpretação de resultados em períodos curtos, em até 4 a 6 horas. Tais novidades já apresentam bons resultados em diferentes estudos de implementação em laboratórios de microbiologia clínica, com a detecção rápida de fenótipos de resistência como a produção de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL), carpapenemases, resistência a meticilina em Staphylococcus aureus e resistência induzida à clindamicina ^1,3,4,6.

Alguns pesquisadores propuseram a metodologia RAST ⁸, e a EUCAST publica os direcionamentos e parâmetros técnicos para a implementação e interpretação dos resultados em laboratórios clínicos ⁶. Os princípios e aspectos importantes da metodologia incluem:

• Consiste na inoculação direta do conteúdo do tubo de hemocultura positivo em meios Mueller-Hinton (ou Mueller-Hinton-F) utilizando 100 a 150 ul diretamente a partir de tubo de hemocultura, sem centrifugação ou diluição do inóculo. Tanto os frascos de cultura em aerobiose ou anaerobiose podem ser utilizados, em meio de cultura contendo sangue de carneiro ou de cavalo quando necessário, temperatura de 35 ⁰C (variação de 1 ⁰C), com suplementação de 4-6% de CO₂ para Streptococcus pneumoniae;
• O tubo de hemocultura positivo deve ser inoculado em 0 a 18 horas depois do resultado positivo. O frasco de hemocultura positivo deve ser mantido em temperatura ambiente por até 3 horas ou até 18 horas incubado no sistema automatizado antes da realização do RAST;
• A partir do tubo positivo de hemocultura, o sangue pode ser transferido diretamente para placas redondas de 90mm com meios sólidos por gotejamento com o uso de pipeta ou seringa estéril com volumes ajustados para as dimensões das placas, e semeadura homogênea extensiva;
• A leitura deve ser criteriosa, feita por profissional com treinamento, em períodos após 4, 6 ou até 8 horas de incubação. Deve-se realizar a leitura em 16-20 horas somente em casos de impossibilidade de leitura nos períodos citados acima, e seguir os valores de diâmetro de halo para esse período. Em casos de impossibilidade de leitura em tempo precoce, deve-se realizar nova leitura nos horários subsequentes. Deve ser considerado positivo somente quando um halo de inibição for evidente. Os pontos de corte são específicos para cada espécie, para cada tempo de incubação e para essa metodologia a partir de frascos de hemocultura. A leitura deve ser realizada com a placa aberta;
• Deve-se ter atenção quanto a área intermediária de incerteza técnica (ATU) na leitura do halo de inibição em que não se pode determinar a categorização entre suscetibilidade ou resistência;
• O método já foi validado para as seguintes espécies: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium e Acinetobacter baumannii ^2,5;
• O RAST para a detecção dos fenótipos de produção de beta-lactamases de amplo espectro e carbapenemases já foram validados para coli e K. pneumoniae;
• O RAST não pode ser utilizado com culturas polimicrobianas;
• As colônias isoladas em zonas de inibição para Pseudomonas aeruginosa frente a piperacilina-tazobactam, imipenem e meropenem após 16-20 horas de incubação, consistem em resultado de inóculo pesado e período prolongado de incubação;
• A metodologia deve ser validada em cada laboratório onde ocorre a implementação com, no mínimo 5 repetições em dias distintos, uso de controle de qualidade e comparação dos resultados.

 

Conclusão

Métodos automatizados para detecção de patógenos e mecanismos de resistência podem auxiliar no tratamento eficaz de infecções bacterianas e estão em constante desenvolvimento.  As orientações técnicas e o detalhamento metodológico podem ser obtidos no site do EUCAST, listado nas referências deste artigo ⁹, o qual apresenta documentos atualizados com conteúdo preciso para a implantação do RAST, especificações para o controle de qualidade, antimicrobianos e concentrações validadas para cada espécie, tabelas de cortes específicos e estudos de validação já realizados.